Im 16. Jahrhundert stehen bedeutende Gelehrte in enger Verbindung zur Hofbibliothek.
Wolfgang Lazius (1514–1565) ist Professor für Medizin an der Universität Wien und offizieller Historiograf Kaiser Ferdinands I. (1531–1564). Er bereist Bibliotheken, Klöster und Archive im Auftrag des Kaisers, um die Geschichte des Herrscherhauses und der dazugehörigen Länder zu erforschen. Von drei großen Bibliotheksreisen, die ihn unter anderem nach Admont, Seckau, St. Lambrecht, Friesach, Gurk, St. Paul, Cilli, Krain und in die Vorlande führen, kehrt er mit ansehnlicher Beute nach Wien zurück.
Schon seit der Regentschaft Maximilians I. ist die Bedeutung des Buchdrucks und damit in verstärktem Ausmaß auch die Bedeutung der Wissenschaften, der Historie, der Genealogie, der Heraldik und der Ikonologie erkannt worden, um Herrschaftsansprüche zu legitimieren, Macht zu konzentrieren und das Erbe zu sichern. Mehr und mehr verändern sich daher die Vorstellung und die Funktion der Bibliothek von einem Teil des Schatzes hin zu einem Ort des Wissens und des kulturellen Gedächtnisses. Die Aufgabe der Bücher besteht nicht länger mehr darin, einfach schön zu sein und an geheiligten Orten zu liegen, sondern mit einem Mal wird auch das Unscheinbare wichtig, das Wissen, das sich darin verbirgt.
In der 2. Hälfte des 16. Jahrhunderts wird die kaiserliche Bibliothek durch gelehrte Büchersammler wesentlich vermehrt: Der Diplomat Augerius Gislain von Busbeck (1522–1592) kauft in Konstantinopel als Gesandter des Kaisers wertvolle griechische Handschriften an, von denen noch über 270 nachweisbar sind. Aus der Sammeltätigkeit des Johannes Sambucus (1531–1584) in Italien stammen über 560 griechische und lateinische Handschriften und der Katalog des Hans Dernschwamm (1494–1568), des Verwalters der vom Kaiser an die Fugger verpachteten Kupfergruben in Neusohl, gibt 651 Werke an, die nach seinem Tod für die kaiserliche Bibliothek in Wien angekauft wurden.
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