An der Wiege des Buchdrucks: Der Bestand an Handschriften bildet die Keimzelle der Österreichischen Nationalbibliothek und gehört zu den weltweit bedeutendsten Sammlungen. Unter den spätantiken, mittelalterlichen und neuzeitlichen Stücken finden sich Hauptwerke aus fast allen Schriftkulturen. Auch alte Drucke werden hier verwahrt: Inkunabeln, Druckschriften von 1501 bis einschließlich 1850 sowie besonders seltene, wertvolle oder bibliophile Drucke ohne zeitliche Begrenzung und Sonderbestände wie hebräische, chinesische oder japanische Schriften.

Prachthandschriften der Frühzeit, vor allem aus dem Besitz von Kaiser Friedrich III. (1415/1452-1493), Kaiser Maximilian I. (1459/1508-1519) und Kaiser Ferdinand I. (1503/1531-1564) machen einen Großteil der Handschriftensammlung aus. Eines der beeindruckendsten Werke ist der byzantinische Wiener Dioskurides, eine botanisch-pharmakologische Sammelhandschrift, die in Konstantinopel um 512 hergestellt wurde und zum Weltdokumentenerbe der UNESCO zählt. Höhepunkte der Sammlung sind auch die Wiener Genesis aus dem 6. Jahrhundert, der Hrabanus-Maurus-Codex aus dem 9. Jahrhundert, die Admonter Riesenbibel von ca. 1150, die berühmte Wenzelsbibel (um 1400) oder ein Prachtexemplar der Cicero-Reden aus dem 15. Jahrhundert aus der Bibliothek des Matthias Corvinus.

Die Inkunabelsammlung ist mit rund 8.000 Exemplaren eine der wertvollsten Sammlungen ihrer Art weltweit. Etwa ein Fünftel aller im 15. Jahrhundert gedruckten Titel sind vorhanden, wie zum Beispiel das einzige in Österreich verbliebenen Exemplar der 42zeiligen Gutenberg-Bibel (Mainz 1454/55).

Der Druckschriftenbestand von 1501 bis 1850 zählt mit mehreren hunderttausend Drucken zu den größten der Welt. Die Sammlung verwahrt bedeutende Druckwerke aus den Ländern der Habsburgermonarchie, Bücher in allen europäischen Kultursprachen sowie seltene, unikale Drucke aus allen Erdteilen. Bedeutend ist auch die Sammlung an historischen Einblattdrucken, Herrscherpatenten, Zirkularen und Dekreten, einzigartig der Bestand an Flugblättern und Amtsdruckschriften zur Revolution 1848.

In der Sammlung befindet sich schließlich auch ein umfangreicher Bestand an historischen Zeitungen und Zeitschriften, der unter anderem das 1703 gegründete „Wiennerische Diarium“ enthält, das noch heute als „Wiener Zeitung“ fortbesteht und somit als älteste noch erscheinende Tageszeitung der Welt gilt.